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          新聞動態
          G-418的使用方法
          發布于:2011-01-27 0:27:02 點擊次數:6389次  

          G-418 Sulfate

          別名:G-418 sulfate;Geneticin
          分子式:C20H40N4O10·2H2SO4         分子量:692.71    CAS#:108321-42-2

                真核表達篩選用抗生素,可以用于篩選表達特定抗性基因的穩定細胞株。篩選哺乳動物細胞,篩選濃度銳減為400ug/ml;篩選植物細胞,推薦其實篩選濃度為10ug/ml;篩選酵母細胞,推薦起始濃度為500ug/ml。根據其實濃度的效果可以適當升高或降低G-418的使用濃度。

          加藥時間
          由于基因轉染到細胞內之后要一段時間才能表達出蛋白質。所以篩選不能太早;但是也不能太晚,因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷較大,增值較慢,時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒,最終導致篩選不出陽性克隆,一般要在轉染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都回下降,所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200ug/ml。
          培養液
          加藥篩選約6天左右,細胞會大量死亡,孔中只剩下的細胞寥寥無幾。這時會出現兩個問題:1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質,導致那些有neo表達的陽性細胞死亡,即非選擇性死亡。2.孔中細胞數目很少,細胞之間的信號會變得很弱,也會導致陽性細胞的狀態不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養液:假如你要轉染3T3細胞,在3T3細胞匯合度達到80%的時候,換液,培養過夜之后收集培養液,通過濾器消毒,和新鮮的培養液按1:1混合備用。再轉染后篩選過程中就可以應用這種培養基。
          挑選單克隆的優化
          為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率,可以應用套環法或刮除法結合有限稀釋法來篩選陽性克隆。加藥后,在高倍鏡下,陽性克隆和陰性克隆很容易辨認,在陽性克隆下用記號筆做個標記。然后刮除隱性克隆,消化陽性克隆后繼續篩選培養;或則用套環套住陽性克隆,在套環內加胰蛋白酶或EDTA消化,把消化液吸到另外一個新的孔中培養。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。
          鑒定之后
          一般經過4周左右的篩選,得到的陽性克隆都比較穩定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話,目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了,而且是隨機整合,會導致表達的目的蛋白的量產生很大差異。隨著培養時間的延續,那些丟失了外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會占據優勢,強表達目的蛋白的細胞會越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。只有經過2次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強分泌目的蛋白的,遺傳穩定的細胞克隆。

          1.G418的配制 1g G418溶于1ml 1MHEPES液中,加蒸餾水至10ml,過濾消毒,4度保存。
          2.細胞培養
          取待測培養細胞,制備成細胞懸液,按等量接種入多孔培養板中,培養6小時左右開始加藥。
          3.
          制備篩選培養基:在100ug/ml1000ug/ml范圍內確定幾個梯度,比如先做個100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml,按梯度濃度用培養基稀釋G418制成篩選培養基。
          4.G418篩選: 吸除培養孔中培養基,PBS洗滌一次,每孔中加入不同濃度的篩選培養基。
          5.換液:根據培養基的顏色和細胞生長情況,每3~5天更換一次篩選培養基。方法同4。
          6.確定最佳篩選濃度:在篩選1014天內能夠殺死所有細胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳G418濃度的可能性不大,最有可能的是出現這種情況:用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細胞,而用下一個梯度的 G418的量在10天前就看不到活細胞了。假如是400ug/ml不能殺死細胞,而800ug/ml在第5天就把所有細胞都殺死了,則可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml進一步篩選,以確定最佳篩選濃度!心得:由于特性明確的細胞系G418的最佳用量還是比較穩定的,所以有時候不需要在這么大范圍內進行篩選。比如說你要轉染NIH3T3細胞 ,現在我告訴你我測試過NIH3T3細胞對G418的敏感性,我用的篩選濃度是200 ug/ml。這時你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個濃度進行篩選。
          通過預實驗確定了最佳篩選濃度后,就可以做穩定轉染了。
          a 轉染:轉染后培養24小時或者更長,到細胞增長接近匯合時按14密度傳代,繼續培養,待細胞密度增至50%~70%匯合時;
          b G418:去掉培養液,PBS洗一次,加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養基。
          c 換液:根據培養基的顏色和細胞生長情況,每3~5天更換一次篩選培養基。當有大量細胞死亡時,可以把G418濃度減半維持篩選。 篩選1014天后,可見有抗性的克隆出現,停藥培養,待其逐漸增大后;
          d 挑單克。褐苽浼毎麘乙,細胞計數,用培養基稀釋細胞到1/10ul。在96孔板中加入培養基150ul/孔,再加入細胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉入到48孔中增殖。
          e 單克隆鑒定:細胞大量擴增后,提取總RNA,做RT-PCR檢測目的基因是否存在。

           

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