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          新聞動態
          核酸原位雜交
          發布于:2011-01-27 0:25:06 點擊次數:5912次  

          原位雜交不需要從組織中提取核酸,對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性,并可完整地保護組織和細胞的形態,更能準確地反映出組織細胞的相互關系及功能狀態。 
            核酸原位雜交的主要過程 : 
            核酸原位雜交按檢測物的不同,分為細胞內原位雜交和組織切片內原位雜交。根據所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA雜交。但不論哪一種形式的雜交,都必須經過五大過程,即組織細胞的固定,預雜交、雜交、沖洗和顯示。 
            一.組織細胞的固定 
            進行核酸原位雜交的組織或細胞必須經過固定處理。適宜核酸雜交的理想的固定液應具備下列特點:1.能很好地保護組織細胞的形態。2.對核酸無抽提、修飾與降解作用。3.不改變核酸在細胞內的定位。4.對核酸與探針的雜交過程無阻礙作用。5.對雜交信號無遮蔽作用。6.理化性質穩定、價格低廉。 
            病理組織學常用的固定液均可用與核酸原位雜交是組織和細胞的固定,但各具優缺點。一般而言,4%多聚加全市應用最為廣泛的固定液之一,它能很好地保持組織或細胞內的RNA,一般固定10-15分鐘RNA的含量比較恒定。10%的甲醛液雖然可促進DNA雙鏈分子的交聯進而變性,但用含50%的甲酰胺雜交液進行雜交可解決。乙醇:冰醋酸(3:1)雖然廣泛用于核酸原位雜交時的組織細胞固定,不過固定后組織細胞內RNA明顯減少,但同時本底也很低。由于固定的時間一是一個影響原位雜交的重要因素,因此還必須根據具體實驗摸索出適合自己要求的固定液與固定時間。 
            二.預雜交 
            核酸原位雜交時,由于組織細胞中的核酸都與細胞內蛋白質結合,以核酸蛋白質復合體的形式存在與細胞漿或細胞核中,固定過程中固定液的交聯作用時胞漿或胞核內的各種生物大分子形成網絡,影響探針的穿透力,阻礙雜交體的形成。因此,需進行預雜交的過程,其目的是去除核酸表面的蛋白質,屹立與核酸探針對靶核酸進行雜交。常用去垢劑(detergeat)和/或蛋白酶對組織細胞進行部分的消化酶解以去除核酸表面的蛋白質。常用的去垢劑由Triton-X100和十二烷基碘酸鈉(SDS),常用的蛋白酶有蛋白酶K等。蛋白酶K的純度、濃度、消化的時間在不同的組織細胞中相差極大,因此,必須進行一系列的預試驗,找到適當的濃度及消化時間。 
            三、雜交 
            雜交過程是核酸原位雜交技術的主要環節,包括以下重要內容。 
            1、探針的選擇 核酸原位雜交中所用的探針可以是雙鏈的DNA(dsDNA)也可以是單鏈的DNA(ssDNA),或為RNA。近年來人工合成的寡核苷酸也得到了廣泛應用。一般而言,標記的DNA或RNA探針都可用于DNA或RNA的定位,其長度為50-300bp(堿基)最好,這個長度范圍的探針在組織細胞中的穿透力好,雜交效率高。常用的探針有: 
           。1)雙鏈DNA探針。常用于雜交的探針之一,可通過切口平移標記或隨機引物標記法標記。后者與前者相比,能產生高比活的探針,但標記探針的產量較低,不適合大量切片的原位雜交。 
           。2)人工合成脫氧寡核苷酸?捎蒁NA合成儀合成,與克隆的DNA相比,人工合成脫氧寡核苷酸有下列優點:特異性較高,當DNA順序未知時可按氨基酸順序進行合成,可用于相似基因順序差異研究;可用合成的不同順序探針對特定基因進行最佳雜交條件的篩選;由于分子量小,與相同量的dsDNA探針相對而言,具有高得多的摩爾濃度。 
           。3)單鏈cDNA探針。單鏈cDNA探針常通過克隆載體M13獲得。ssDNA探針與dsDNA探針相對比,其最大優點在于,ssDNA探針不會像dsDNA探針那樣與自身互補的第二條鏈復性雜交,增加了探針的有效濃度。 
           。ㄗⅲ篗13是大腸桿菌絲狀噬菌體系列中的一個。含有6400個左右的核苷酸單鏈閉環DNA分子。在用作克隆載體時,可以產生大量含有外源性DNA某一條鏈的DNA分子。)
           。4)單鏈反義RNA探針?捎蓸嫿ǖ腞NA表達載體而獲得。在RNA聚合酶的作用下,以DNA為模板合成反義RNA探針。這種探針與切口平移標記的DNA探針相比,特異性高,RNA/RNA形成的雜交分子具有熱穩定性,而且探針的大小也比較恒定,因而增加了雜交的敏感性及均一性。此反義RNA探針不含有載體順序,減少了非特異性雜交,還能防止dsDNA中第二條鏈的競爭性雜交。雜交后用RNA酶消化單鏈未雜交的探針,可明顯減少本底。因此,RNA探針在核酸原位雜交中的應用也越來越廣泛。 
           。5)反義寡核苷酸探針。見合成的20-70個寡核苷酸克隆到RNA表達載體上而獲得。這種探針既有寡核苷酸探針的優點,又有cDNA探針的優點。 
            2、探針的標記 主要可分為放射性標記與非放射性標記兩種方法。 
           。1)放射性標記。常用標記探針的放射性核素有32P,35S,14C,3H,125I。放射性核素的敏感性高,方法簡便,操作穩定,可應用核乳酸或X光片通過放射自顯影的方法檢測。3H標記探針的放射性自顯影分辨率高,但其曝光時間長;32P與35S,是原位雜交應用多而廣的放射性核素,由于其能量高,常在幾天內可得到結果,35S優于32P。14C和125I的分辨率差。很少用于原位雜交。 
           。2)非放射性標記。與放射性核素標記探針相比,非放射性標記具有安全、無放射性污染,穩定性好,顯色快而易于觀察等特點。其中生物素(Biotin)標記應用最多、最廣。還有應用地高辛標記,熒光素標記,堿性磷酸酶標記,溴脫氧嘧啶標記等。 
            3、雜交的條件 原位雜交的一個主要優點是,其雜交反應的特異性可通過調節反應條件而進行精確的控制。雜交的特異性依賴于探針的結構、雜交溫度,PH值及雜交液中甲酰胺和鹽離子的濃度。堿基的錯配可經過控制嚴格的雜交條件而排除。 
            DNA分子雜交實質上是雙鏈DNA的變性和具有同源序列的兩條單鏈的復性過程。 
            維持DNA螺旋的力主要是氫鍵的疏水性相互作用。氫鍵是一種次級鍵,能量較低。因此,加熱、有機溶劑及高鹽濃度等均可導致DNA二級結構發生破壞,DNA二級雙螺旋解旋,兩條鏈完全結離,但未破壞其一級結構。此過程稱為DNA的變性(denaturation)。 
            變性的DNA兩條互補單鏈,在適當條件下重新締合形成雙鏈的過程稱為復性(renaturation)或退火(annedling)。 
            復性并不是變性反應的一個簡單逆反應過程。復性的過程是相當復雜的,變性過程可以在一個極短的時間迅速完成,而復性則需要相對較長的時間才能完成。如果使熱變性的DNA溶液迅速冷卻,則只能形成一些不規則的堿基對,而不會完全恢復DNA雙鏈結構。 
            因此,建立合適的雜交條件是保證核酸原位雜交成敗的關鍵。 
           。1)溫度與DNA的堿基組成,一般變性的溫度為85-90℃左右,但這并不是一個常數,若DNA中(G+C)的百分比愈高,變性溫度也愈高,一般而言,(G+C)的百分比含量每增加1%,變性溫度上升0.41℃左右。 
            一般情況下,在不含甲酰胺時,大多數雜交反應在68℃進行,當含50%甲酰胺時,在42℃進行。 
           。2)PH值。溶液的PH值對變性也有一定的影響。PH值在5-9范圍內,變性溫度值變化不明顯。在高PH值下,可使堿基失去形成氫鍵的能力。當PH值大于11.3時,所有氫鍵均被破壞,DNA完全變性。 
           。3)離子強度。離子強度過低,不利于復性,常采用0.15-1.0mol/L溶液進行復性研究。正離子可以封閉磷酸基因的負電荷,使DNA雙鏈的穩定性增加,不利于變性。 
            四、沖洗 
            雜交后沖洗是減低非特異性雜交的關鍵步驟,其SSC的濃度可低至0.1×SSC。 
            應用放射性核素探針時,沖洗可達幾小時,而用生物素及地高辛等標記的探針沖洗時間則可縮短為15分鐘。 
            沖洗時溫度不能高于50℃,否則將導致組織細胞結構的破壞及組織或細胞從切片上脫落,使實驗失敗。 
            五、顯示 
            核酸原位雜交結果的顯示應體現特異性和敏感性。當DNA探針長度超過0.5Kb時非特異性雜交增多,本底增高。此外,探針與無關基因中部分同源順序的非特異性結合亦是非特異性雜交的原因之一。除探針的非特異性結合外,檢測系統亦是導致非特異性結果的原因之一。生物素標記的探針,常用免疫組織化學技術檢測,在許多組織中因含有內源性生物素(維生素H)而出現假陽性結果。地高辛標記就不存在這種問題。 
            高度敏感是原位雜交的優點之一,用放射性標記的DNA探針可檢測到細胞內20個拷貝的mRNA。組織的固定與雜交條件對敏感性也會產生影響。組織切除后若不及時固定,可能會由于mRNA的降解而影響結果導致假陰性的出現。探針的長短、濃度、在組織中的穿透力、雜交及雜交后的沖洗嚴格性、檢測系統的靈敏性等都可產生假陽性或假陰性結果。 
            核酸原位雜交的高度敏感性和特異性,如果沒有確切的陽性或陰性對照則很難加以評定,因此,除探針的選擇應通過鑒定外,必須在每一次試驗中選擇陽性或陰性對照。陽性對照可選擇①Northern或Southern印記雜交,②將原位雜交與免疫組織化學聯合應用。③用不同互補探針與靶核酸雜交。陰性對照可選擇①用非標記cDNA預雜交,②用無關的非特異順序(如載體)等作探針,③雜交前用RNA酶或DNA酶消化處理切片。
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