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          新聞動態
          考馬斯亮藍G-250與R-250的區別
          發布于:2011-08-26 16:42:28 點擊次數:475次  

            考馬斯亮藍有G250和R250兩種,在顏色索引(Colour Index)中給出了不同的編號(42655和42660)。亮藍G和亮藍R在冷水中分別為微溶和不溶,在熱水和乙醇中分別為可溶和微溶。兩種染料均能對固定的蛋白進行有效地染色,使用濃度為溶于甲醇:冰醋酸:水(50:10:40)的0.05%溶液?捡R斯亮藍G250與蛋白質的結合反應十分迅速,是常用的蛋白染料,染色后為藍綠色,常用來作為蛋白質含量的定量測定?捡R斯亮藍R250與蛋白質結合雖然比較緩慢,但是燃料可以穿透凝膠,染膠效果好,染色后為紅藍色,且可以被洗脫下去,所以可以用來對電泳條帶染色。G250也可染膠,但染色過程慢且染色后背景高,脫色困難。

             考馬斯亮藍R250(Coomassie brilliant blue R-250)為三苯基甲烷(triphenylmethane),每個分子含有兩個SO3-H基團,本身偏酸性,磺酸基與蛋白質的堿性基團結合形成染料-蛋白質復合物。MW=824,λmax=560-590nm?捡R斯亮藍R-250是通過范德瓦爾鍵與蛋白質結合,可以被洗脫下去,尤其適用于SDS電泳微量蛋白質染色,染色靈敏度比氨基黑高5倍。它與不同蛋白質結合呈現出基本相同的顏色,并且在比較寬的范圍內(15-20g),掃描峰的面積與蛋白量呈線性關系。但蛋白質濃度超出一定范圍時,對高濃度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定量分析時要注意這點。

              考馬斯亮藍G250(Coomassie brilliant blue G-250)為二甲花青亮藍(xylene cyanine brilliant blue),是一種甲基取代的三苯基甲烷。比考馬斯亮藍R250多二個甲基,MW=854;λmax=590-610nm,游離狀態下呈紅色。染色靈敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。其優點在于它在三氯乙酸中不溶而以膠體形式存在,能選擇性地和蛋白質形成復合物,染色迅速,著色深的蛋白質區帶在數秒內即可顯現出來,約45分鐘后著色最深,成本低,重復性好。當它與蛋白質結合后變為青色,蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比,因此可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡,完成反應十分迅速;其結合物在室溫下1h內保持穩定。該法是1976年Bradford建立,試劑配制簡單,操作簡便快捷,反應非常靈敏,靈敏度比Lowry法還高4倍,可測定微克級蛋白質含量,測定蛋白質濃度范圍為0~1,000μg/mL,是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。。
            考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程

            該方法用于大多數蛋白質的定量是比較精確的,但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0.2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
            1.Bradford濃染液的配制:將100rug考馬斯亮藍G-250溶于50m1 95%乙醇,加入100ml濃磷酸,然后,用蒸餾水補充至200ml,此染液放413至少6個月保持穩定。
            2.標準曲線蛋白質樣本的準備:盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品,例如測定抗體,可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的,也可用抗體作為標準蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標準曲線。
            3.將待測樣本溶于100~1緩沖溶液中,該緩沖溶液應與制作標準曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。
            4.按1:5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液,如出現沉淀,過濾除去。
            5.每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液,作用5~30rain。染液與蛋白質結合后,將由紅色變為藍色,在595nm波長下測定其吸光度。注意,顯色反應不得超過30min.
            6.根據標準曲線計算待測樣本的濃度。
          考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質通過范德華力結合,反應快速,并且穩定,無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右,皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙。

            考馬斯亮藍R-250是電泳專用的
            考馬斯亮藍G250和R250都可以染蛋白,一般用R250,G250染色后背景較深不易脫色。 一般R250 染蛋白,G250 一般測蛋白濃度,也可染膠,敏感性更高但較慢脫色較難。
            考馬斯亮藍G250常用的蛋白染料,作定性試驗用,染色后為藍綠色;R250較敏感,做定量實驗用,染膠效果較好.染色后為紅藍色 。

           

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