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          新聞動態
          MTT原理及其溶液的配制方法
          發布于:2011-08-13 21:29:06 點擊次數:12577次  

          MTT原理
          MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,漢語化學名為 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,商品名:噻唑藍。是一種黃顏色的染料。
          MTT比色法,是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚,用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值,可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內,MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。
            缺點:由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水,需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加,也會對實驗結果的準確性產生影響,而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。
          MTT 溶液的配制方法
              通常,此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此,可以稱取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸緩沖液(PBS)或無酚紅的培養基中,用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌,放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的過程中,容器最好用鋁箔紙包住。實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光,覺得這樣比較好。
              需要注意的是,MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力,但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候,為了保證實驗結果的線性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內。
          MTT一般最好現用現配,過濾后4&ordm;C避光保存兩周內有效,或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存,避免反復凍融,最好小劑量分裝,用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里,用的時候現配,直接往培養板中加,沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。
          MTT有致癌性,用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌,MTT對菌很敏感;往96孔板加時不避光也沒有關系,畢竟時間較短,或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.
          配制MTT時用PBS(ph=7.4)溶解。PBS配方:Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g調pH 7.4,定容1L。
          普通MTT法實驗步驟
          1:接種細胞:用含10%胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液,以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板,每孔體積200ul.
          2: 培養細胞:同一般培養條件,培養3-5天(可根據試驗目的和要求決定培養時間)。
          3:呈色:培養3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul.繼續孵育4 h,終止培養,小心吸棄孔內培養上清液,對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。
          每孔加150ul DMSO,振蕩10min,使結晶物充分融解。
          4:比色:選擇490nm波長,在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值,記錄結果,以時間為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
          藥物MTT法實驗步驟
          貼壁細胞:
          1: 收集對數期細胞,調整細胞懸液濃度,每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度 1000- 10000 孔,(邊緣孔用無菌PBS填充)。
          2: 5%CO2,37℃孵育,至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上,細胞貼壁后即可加藥,或兩小時,或半天時間,但我們常在前一天下午鋪板,次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個,否則難以反應真實情況
          3: 5%CO2,37℃孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。
          4: 每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應,可先離心后棄去培養液,小心用PBS沖2-3遍后,再加入含MTT的培養液。
          5: 終止培養,小心吸去孔內培養液。
          6: 每孔加入150ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
          7: 同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)。
          懸浮細胞:
          1: 收集對數期細胞,調節細胞懸液濃度1×106/ml,按次序將①補足的1640(無血清)培
          養基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培養液稀釋 (儲存液100mg/ml,需預試尋找最佳稀釋度,1:10-1:20);③需檢測物10ul;④細胞懸液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設對照(加100ml 1640)
          2: 置37℃,5%CO2孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。
          3: 每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4 h。(懸浮細胞推薦使用WST-1,培養4 h后可跳過步驟4),直接酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值)
          4、離心(1000轉x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值。
          5、同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜),每組設定3復孔。
          注意事項:
          (1) 選擇適當得細胞接種濃度。
          (2) 避免血清干擾:一般選小于10%的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔 內殘余培養液。
          (3) 設空白對照:與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致,最后比色以空白調零。
          (4) MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間,超出這個范圍就不是直線關系。
          (5) 用96孔板培養細胞做MTT測細胞活力,應該加多少1640培養基,多少MTT和DMSO合適根據書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養液,便于DMSO溶解甲臜顆粒進行比色測定
          (6) 一般每孔4000個細胞為宜,既細胞濃度在20000個/ml,MTT加20ul,作用四小時后洗掉上清液,注意不要將甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脫色搖床上振蕩10分鐘,然后測吸光值。

           

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